Western Blotting이란 무엇이며 어떤 기능을 합니까?
Western Blotting(또는 immunoblotting)은 단백질 검출, 특성화 및 정량화를 위해 사용되는 기법입니다. 우선 이 과정은 대상 단백질을 포함한 단백질 혼합물을 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동분리하는 것입니다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 막으로 전달되거나 블로팅 되어 단백질을 고정시킵니다. 적합한 항체를 사용하여 단순한 항원-항체 반응으로 관심 대상 단백질을 검출합니다. 1차 항체를 사용하여 관심 대상 단백질에 고정하고 이후 2차항체를 이용하여 항원-항체 복합체를 검출합니다. 관심대상 단백질은 막에 밴드로 시각화 됩니다.
Western Blotting 애플리케이션
Western Blotting을 사용하면 단백질을 존재유무, 단백질 양, 인산화 상태 또는 국소화 등 다양한 측면에서 단백질을 특성화할 수 있습니다. 이러한 정성적인 측면 외에도 Western Blotting은 실험군과 대조군 샘플 사이의 밴드 강도를 기반으로 한 단백질의 상대적 정량화에 사용할 수 있습니다.
Western Blotting 항체
Western Blotting에서 monoclonal antibodies 및 polyclonal antibodies는 모두 항원의 면역탐색을 위해 사용됩니다. monoclonal antibodies는 하나의 B세포에서 파생되는 반면 polyclonal antibodies는 다른 B세포에서 생성되지만 모두 특정 항원을 인식할 수 있는 능력이 있습니다. 두 가지 모두 각각의 장점과 단점이 있지만 특이도가 중요한 경우 monoclonal antibodies를 선호합니다. monoclonal antibodies는 polyclonal antibodies에 비해 특이성이 높고 더 깨끗한고 신뢰도가 높은, 재현 가능한 결과를 제공합니다. 그러나 monoclonal antibodies는 값이 더 비싸고, 실험 프로토콜을 진행하는 동안 항원에 대한 절차적 수행에 대한 tolerance가 낮습니다. polyclonal antibodies는 상대적으로 특이성이 낮지만 항원에 대한 더욱 포괄적인 지식을 제공하고, 단백질에 대한 정성적 정보를 얻는데 용이합니다.
Western Blotting을 위한 1차항체, 2차항체 및 대조군
일반적으로 1차항체는 특정 단백질 또는 epitope를 인식하고 이후 검출을 가능하게 하기 위해 형광 dye 또는 효소에 접합되거나 부착됩니다. 부착된 항체는 직접 검출되고(직접 Western Blotting) 또는 2차항체를 이용하여 검출(간접 Western Blotting)됩니다. 방법에 따라 효소 또는 형광 dye에 접합된 항체를 사용하여 2차 검출을 수행합니다. Horseradish peroxidase(HRP)는 tagging에 사용되는 가장 일반적인 효소입니다.
이러한 형광dye-접합 항체는 형광dye의 특성을 활용하여 특정 파장에서 빛을 흡수하고 다른 파자에서 빛을 방출합니다. 다양한 필터 조합을 사용하여 특정 파장의 빛을 측정할 수 있습니다. 전체 빛 스펙트럼에 걸쳐 흡수 및 방출 최대값을 가진 형광dye을 사용할 수 있기 때문에 서로 다른 파장의 형광dye에 결합된 항체 조합을 이용하여 다양한 단백질을 검출할 수 있습니다. 여러 중요 생물학적 표적 단백질에 대해 표지된 항체를 상업적으로 사용할 수 있습니다.
2차 항체는 신호 검출 및 증폭을 촉진시킵니다. 보통 1차 항체가 만들어진 종의 IgG 부분에 대해 표시됩니다. 따라서 1차 항체가 host species 종과 sample species을 고려해야 합니다. (예: 마우스 샘플을 이용하는 경우 1차 항체는 마우스에서 추출된 것이 않아야 합니다. 왜냐하면 2차항체가 비특이적 마우스 IgG에 반응 할 수 있기 때문입니다.)
형광 및 화학발광 검출
형광 또는 화학발광 기반의 검출 방법은 보통 실험에서 이용하는 1차 항체를 기반으로 한 항원-항체 복합체의 검출에 사용됩니다.
형광기반 2차 검출에서 형광dye와 결합한 2차 항체는 1차 항체를 결합하기 위해 사용되며 디지털 이미지 기기를 이용하여 신호를 검출합니다.
화학발광 검출에서 HRP에 결합된 2차 항체는 1차 항체를 결합하기 위해 사용됩니다. 이 방법에서는 신호 검출을 위해 자동 방사선 촬영 또는 디지털 이미지 기기를 이용합니다.
항체에 일반적으로 사용되는 형광염료는 다음과 같습니다.
- Phycoerythrin , PE
- (Peridinin chlorophyll protein, PerCP
- Fluorescein isothiocyanate, FITC
- Allophycocyanin , APC
Western Blotting과ELISA: 차이점은 무엇인가요?
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)는 단백질 분석에서 널리 사용되는 또 다른 유형의 면역 분석법입니다. Western Blotting에서와 마찬가지로 ELISA를 이용해 단백질을 검출하기 위해서는 항원에 결합된 항체를 이용하며 하나의 항체(직접 ELISA) 또는 1차, 2차 항체(간접 ELISA)를 이용하여 수행할 수 있습니다. ELISA는 colorimetric 또는 효소기반의 방법을 이용하여 검출합니다.
Western Blotting과 달리 ELISA는 플레이트에 고정된 특정 항체로 플레이트에서 수행할 수 있습니다.
ELISA를 사용하는 경우보다 Western Blotting을 사용하는 경우 특이성이 훨씬 높게 나타납니다. ELISA는 주어진 시간에 단일 단백질을 검출할 수 있지만 Western Blotting을 이용하면 형광dye 결합 항체를 이용하여 여러 단백질을 검출할 수 있습니다.
Western Blotting을 위한 BD Biosciences의 항체, 시약 및 프로토콜
BD Biosciences는 Western Blotting에 대해 테스트 및 검증된 수 천개의 정제된 monoclonal antibodies와 형광dye 결합 2차 항체를 제공합니다. 여러 HRP 결합 항체 및 대조군 cell lysates도 이용 가능합니다.
또한 여러분을 지원할 수 있는 Western Blotting protocol도 있습니다. 여기서 Western Blotting에 대해 자주 묻는 질문에 대한 답변을 확인할 수 있습니다.
연구용입니다. 진단용 또는 치료용으로 사용할 수 없습니다.
