用高参数流式细胞仪研究新冠患者自然杀伤（NK）细胞免疫分型

SARS-CoV-2感染引起一系列免疫应答，激活先天免疫系统和后天免疫系统。无论这些免疫应答是有针对性受控的，还是无针对性不受控的，它们都可能决定疾病的结果。使用深层免疫分析的最近研究表明，免疫应答的性质也可以决定疾病的严重程度。例如，若未能启动适当的干扰素应答，则与IL-6水平升高、随后发生的细胞因子风暴和新冠疾病的严重程度相关。与后天免疫应答不同，SARS-CoV-2感染的先天免疫应答尚未被详细研究

NK细胞与其在急性病毒感染中的作用

作为先天免疫系统的组成部分，NK细胞能够攻击和摧毁被感染细胞，并参与影响T细胞介导的后天免疫应答。确认了两个主要的NK细胞群体：CD56^bright NK细胞（产生细胞因子）和CD56^dim NK细胞（细胞毒性）。基于NK细胞的临界阈值水平，免疫应答可能是保护性的或会触发免疫病理学现象。已证明NK细胞对各种病毒感染应答迅速。与其他免疫细胞相比，NK细胞在新冠疾病中的作用和性质尚未得到详细的研究。

在论文《与新冠疾病严重程度相关的自然杀伤细胞免疫表型》中，Maucourant等人用高参数流式细胞仪和无监督分析来了解NK细胞如何参与SARS-CoV-2感染应答，以及NK细胞活性与新冠疾病严重程度之间是否存在相关性。他们分析了两组患者的外周血单核细胞，一组是中度（n=10），另一组是重度（n=17）新冠患者，还有一组是SARS-CoV-2 IgG血清阴性和无症状个体的对照组（n=17）。

他们的研究揭示了新冠疾病中NK细胞激活的几个关键模式和细节：

• 使用28色NK细胞聚焦流式细胞仪面板，分析显示，与健康对照组相比，新冠患者的NK细胞高度激活。然而，激活水平与疾病严重程度没有直接关系。对CD56^bright和CD56^dim NK细胞的分析表明，与对照组相比，新冠患者中这些细胞和总NK细胞的绝对计数减少。
• 主要成分分析显示，与对照组相比，患者群体具有明显的集群，表现为与NK细胞群体相关的几种标记物的表达有变化（如CD56^bright NK细胞中的CD98、Ki-67、Ksp37和CD56^dim NK细胞中的Tim-3、CD98、CD38、CD69和Ksp37）。
• 有应答的CD56^bright细胞与无应答的CD56^bright细胞、有应答的CD56^dim细胞与无应答的CD56^dim细胞在标记物表达上存在差异。
• 对差异表达基因的单细胞RNA测序和基因本体富集分析显示，患者和对照群体之间存在不同的基因模块。基因模块具有若干参数，如效应器功能、激活、增殖和干扰素应答。与对照群体相比，患者群体中的表达增加。
• 支气管肺泡灌洗液分析显示，随着干扰素反应、激活/增殖特征和差异表达，出现激活和炎症特征。
• 抑制性受体表达和NK细胞培养分析显示，患者体内NK细胞激活与抑制性KIR表达和NK细胞培养无关。
• 与中度患者相比，重度新冠患者的适应性NK细胞（如NKG2C+CD57+CD56^dim NK细胞）频率更高。这些是增殖和激活标记物，这种适应性NK细胞扩增似乎与患者CMV再激活无关。
• 该论文首次发现，在新冠患者中适应性NK细胞扩增增强。
• 利用FlowJo™10.6.2版本软件和FlowAI、DownSample、Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)和PhenoGraph插件进行流式细胞仪分析，采用无监督方法，显示NK细胞群体集群不同。基于不同临床分类的PhenoGraph集群和分层显示36个集群，标记物相对丰度不同（与疾病表型相关）。
• PhenoGraph集群的相对丰度显示出两种不同的免疫类型：中度和重度免疫类型。
• 对中度vs重度免疫类型的分析表明，MIP-1β、CD98和TIGIT等标记物在中度免疫类型中增加，而穿孔素、NKG2C和Ksp37等标记物在重度免疫类型中增加。
• 对NK细胞应答的更详细分析显示，CD56^bright细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达水平与更严重的新冠患者的表型呈正相关，包括连续器官衰竭评估和血清中持续的SARS-CoV-2病毒血症。此外，在CD56^bright细胞中这些标记物的增加也与多种效应器分子增加呈正相关，与抑制性检查点分子（如TIGIT）呈负相关。
• 对新冠患者可溶性血清蛋白的分析显示，其中一些与CD56^bright细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达有关。某些可溶性因子也与其他病毒感染有关，表明NK细胞激活途径可能在各种病毒感染应答途径中共享。
   

这些结果揭示了新冠患者早期NK细胞应答的详细情况，帮助人们了解免疫应答如何随疾病进展而变化。

随着患者体内促炎细胞因子增加，扩增适应性NK细胞和激活CD56^bright细胞与疾病严重程度有什么相关性，这还需要进一步研究。与其他涉及单核细胞和中性粒细胞的先天免疫应答的关系，也需要进一步研究，以详细了解SARS-CoV-2感染过程中的先天免疫应答。

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