BD FACSChorus™软件

用0.25μg的pAcGFP（Clontech公司）载体转染HEK-293细胞，检测绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins, GFP)的表达。表达不同水平GFP的细胞可以被清楚地分辨出来。DAPI 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）荧光染料用于排除死细胞。在纯度模式下，以1000个活动/秒的速度绘制门控来识别和分类低表达和高表达水平GFP的细胞。分类后分析显示两个分类细胞群的纯度均>99%。

HEK-293细胞用70%乙醇固定，用0.5 μg/mL的 DAPI染色。

(A） 细胞群层次结构。侧散射、前向散射和DAPI的面积、高度和宽度参数依次用于排除双峰和细胞聚集。在这个实验中使用的门控策略可能低估或排除了有丝分裂图。

(B） DNA含量分析。DAPI单重态门内的细胞显示DNA含量在2N和4N之间，从而证实排除了>4N的双峰或聚集体。

(C） 单细胞沉积分选后验证。将DAPI单重态门内的细胞排序为3个96孔板，单细胞沉积效率为99.7%。显微镜检查确认每孔有一个细胞存在。给出了含有一个细胞的代表图像。

从健康献血者中分离外周血单个核细胞，并用表面标记物（CD3、CD4、CD25、CD127和CD45RA）混合物染色以检测和纯化Treg亚群。首先根据光散射特性对淋巴细胞和单体进行门控，然后对CD3⁺CD4⁺ T细胞进行门控（未显示）。然后确定Tregs为CD127^Low/NegtiveCD25^High。从Treg圈门，CD45RA+naïve和CD45RA-记忆Tregs在纯度模式下以5000活动/秒的速度被识别和分类。排序后的分析显示记忆和初始T细胞(Naïve T Cell)的细胞群是同质的。然后对纯化的细胞进行额外的表面标记（CD31、CD39和CD15s）染色以进行免疫分型。CD31+近期胸腺移行细胞（RTEs）在CD45RA+初始T细胞中检测到，而在CD45RA-记忆T细胞中检测到高度激活的T细胞。

机械粉碎和胶原酶消化分离BALB/c小鼠脾细胞。

(A)BD IMag™ 小鼠树突状细胞富集试剂盒批量选择，结果分别富集CD8α+和CD8α - MHC II+CD11c常规树突状细胞35倍和29倍。

(B） 在批量选择之后，CD8α⁺和CD8α-亚群在纯度模式下以1000活动/秒的速度进行分类。分类后分析显示两个分类的亚群纯度>99%。