1 回の実験で最大30 種類の免疫マーカーを同時解析

オリゴ抗体技術により開発されたBD^®AbSeqImmuneDiscoveryPanel（IDP）は、凍結乾燥の30種類の主要なヒト免疫マーカーで構成され、一つのチューブでご使用いただけます。IDP は、BD Rhapsody™ シングルセル解析システムでの解析に最適化されており、BD Rhapsody™ シングルセルRNA アッセイおよびBD^®Single-Cell Multiplexing kit と一緒にご使用いただけます。

さらなる情報はBD^®AbSeq Immune Discovery Panel brochureから

List of BD^® AbSeq IDP Specificities

BD^® AbSeq IDPマーカーリスト

30 pre-titrated antibodies


Specificity	Clone	Oligo ID
CD3	UCHT1	AHS0231
CD4	SK3	AHS0032
CD8	SK1	AHS0228
CD11c	B-Ly6	AHS0056
CD14	MPHIP9	AHS0037
CD16	3G8	AHS0053
CD19	SJ25C1	AHS0030
CD25	2A3	AHS0026
CD27	M-T271	AHS0025
CD28	L293	AHS0138


Specificity	Clone	Oligo ID
CD45RA	HI100	AHS0009
CD56	NCAM16	AHS0019
CD62L	DREG-56	AHS0049
CD127	HIL-7R-M21	AHS0028
CD134	ACT35	AHS0013
CD137	4B4-1	AHS0003
CD161	HP-3G10	AHS0205
CD183 (CXCR3)	1C6/CXCR3	AHS0031
CD185 (CXCR5)	RF8B2	AHS0039
CD186 (CXCR6)	13B 1E5	AHS0148


Specificity	Clone	Oligo ID
CD196 (CCR6)	11A9	AHS0034
CD197 (CCR7)	2-L1-A	AHS0273
CD272	J168-540	AHS0052
CD278	DX29	AHS0012
CD279	EH12.1	AHS0014
CD357 (GITR)	V27-580	AHS0104
CD366 (TIM-3)	7D3	AHS0016
HLA-DR	G46-6	AHS0035
IgD	IA6-2	AHS0058
IdM	G20-127	AHS0198

BD^®AbSeq IDPプロトコール

次の手順に従って、BD^® AbSeq IDP をご使用ください。

凍結乾燥 IDP の再溶解および細胞染色のステップ

IDP チューブをホイルバッグから取り出し、室温になるまで5 分間静置します。
ペレットがチューブの底にあることを確認します。
Nuclease-free water 35 μL をチューブの底に添加し、抗体が再溶解するまで室温で5 分間静置します。
再溶解した抗体は、染色する細胞の準備ができるまで氷上に置いておきます。注記：再溶解した抗体は24 時間以内に使う必要があります。
2X AbSeq labeling master mix を作製するために、65 μL のBD Pharmingen™ Stain Buffer を溶液に添加し、100 μL にします。
Single Cell Labeling with BD^®AbSeq Ab-Oligos』（Doc ID 214394、Rev. 1.0）に従って、調製した細胞懸濁液100μL と混合し、氷上に30 分間静置して、細胞を染色します。
標識した細胞に、BD Pharmingen Stain Buffer（FBS）3 mLを添加し、ピペットで混合します。
各チューブを400 xg で5 分間、遠心します。
各チューブのキャップを外し、転倒させて、上澄み液をバイオハザード廃棄容器に廃棄します。チューブを転倒させたまま、リントフリーワイプに静かに乗せ、チューブの縁に残った上澄み液を除きます。
ステップ7 ～ 9をさらに2 回繰り返して、合計3 回洗浄します。
BD Rhapsody™ Cartridge Reagent Kit 同梱の低温のBD Pharmingen™ Stain Buffer（FBS）620 μL でペレットを再懸濁し、シングルセルの単離ステップに進みます。

『Single Cell Analysis Workflow with BD Rhapsody ™ Systems』（Doc ID：220524）を参照してください。

パフォーマンスデータ

BD^® AbSeq IDPの検証データでは、30 種類の単一バイアルBD^®AbSeq 抗体と同等の性能が示されています。

IDP と単一BD AbSeq 抗体プールで同等の性能全血から分離した末梢血単核球（PBMC）を、休止期（未処理）群と活性（CD3/CD28 で24 時間処理）群に分けました。

A. 休止期のPBMC と活性化PBMC の1：1 の混合物を、IDP または同じAbSeq 特異性を示す抗体プールで染色しました。次に、同数のPBMC をBD Rhapsody™ カートリッジにロードし、AbSeq およびWTA 用ライブラリーを作成して、シーケンスしました（n = 実験回数2 回）。

B. データは、SeqGeq™ソフトウェアおよびDataview ソフトウェアで解析しました。A. UMAP では、IDP とBD^® AbSeq 抗体で染色したサンプルの間に、同様な特定PBMC グループが示されました。B. IDP およびBD^®AbSeq 抗体プールで検出されたAbSeq 分子の総数は、R2 が0.98 を上回る高い相関を示しました。

BD^® AbSeq IDPに含まれる30マーカーすべてについて、複数のドナーからのPBMCに対する検証小結果で、それぞれの個々のターゲットを確実に検出できることを示しています。

IDP に含まれる 30 種類の AbSeq 抗体すべてのパフォーマンス. 同様に、PBMC を活性化し調製しました。染色後、BD Rhapsody™ シングルセル解析システムで細胞を単離し、AbSeq およびWTA 用ライブラリーを作製してシーケンスしました。シーケンス飽和度が 80% を上回るように、Illumina™ NextSeq™ High-Output Kit を用いて、WTA は20,000 reads/cell、AbSeq は30,000 reads/cell でライブラリーをシーケンスしました。

データは、SeqGeq™ シングルセル解析ソフトウェアおよびDataview ソフトウェアで解析しました。以上の実験を、2 人以上のドナーで繰り返して実施しま

した。ここでは、ドナー1 名の代表的な実験結果を示します。A. IDP 抗体を使用したAbseq アッセイとWTA による休止期および活性化PBMC のUMAP 細胞アノテーション。

B. 図2A のUMAP のIDP 由来の各AbSeq クローンに関するヒートマップ。各細胞タイプで検出されたAbSeq マーカーを示します。

研究ニーズに合わせて、パネルに興味のあるBD^® AbSeq 抗体をDrop-ins ( 追加)

IDP は柔軟性の高い基礎パネルで、他のBD^®AbSeq 抗体をDrop-in（追加）することができます。再溶解したIDP ペレットに3 種類のBD^®AbSeq 抗体を追加し、混合しました（n =2）。

A. 高い相関（Drop-in ありとなし：R2 > 0.99）で示されるとおり、IDP の性能はドロップインの影響を受けませんでした。

B. CD8（SK1）およびCD45RA のIDP に含まれるマーカー（上段）を、Drop-in CD8（RPA-T8）、CD45RO、CD38 のマーカー（下段）と比較検討し、UMAP で示しています。CD38 のDrop-in では、CD38 陽性と想定される細胞タイプが検出されました。CD8（RPA-T8）のDrop-in クローンは、IDP クローン（SK1）にきわめて類似した染色パターンを示していて、追加抗体の高い特異性と同一抗原に対する2 種類のクローンの適合性を示唆しています。CD45RA（IDP）と比較した場合のCD45RO（Drop-in）の対照的な発現パターンデータにも示されているように、個別のAbSeq マーカーをIDP に追加しても実験結果に悪影響を及ぼさないことが、さらに確認されました。

IDP はBD Rhapsody ™ RNA アッセイおよびBD^® Single-Cell Multiplexing kit

IDP とBD Rhapsody ™ RNA アッセイおよびBD^® Single-Cell Multiplexing kitの互換性

A. IDP で染色したPBMC（休止期および活性化PBMC の1：1 の混合物）のWTA 用およびAbSeq 用ライブラリーを作製し、シーケンスしました。マルチオミックス解析の性能

を調べるために、WTA データのみの解析（mRNA 解析）を実施し、WTA およびAbSeq のデータ（mRNA およびタンパク質の解析）と比較しました。WTA（mRNA）データのみを用いたUMAP プロットとバイアスなしのクラスタリング（Phenograph）が左、 WTA およびAbSeq（mRNA およびタンパク質解析）のデータを用いたプロットとアノテーションが右に示されています。マルチオミックスアプローチでは、さらなる細胞タイプが明らかになり、より深い生物学的な情報が得られました。

B. BD^®Single-Cell Multiplexing

Kit（SMK）とIDP の適合性を検証するために、SMK およびIDP で同時に細胞染色し、WTA 用、AbSeq 用、SMK 用ライブラリーを作製してシーケンスしました。次に、IDP におけるマーカーの発現を、SMK を使用せず作製したデータと比較しました。IDP ＋ WTA とIDP ＋ WTA ＋ SMK の高い相関（R2 > 0.99）で示されるとおり、これらのデータは SMK を追加してもIDP に影響が及ばないことを示しています。